茶葉不僅有提神的效果，還能消炎殺菌?？赏ㄟ^溶血試驗來檢測生物抗氧化情況。目的和方法：采用分光光度法及電泳法，以離體RBC膜，肝勻漿還原型谷胱甘肽(GSH)水平，質粒DNA損傷程度為檢測指標測定茶多酚對離體生物組織的抗氧化作用。結果：茶多酚能顯著抑制紫外線致人RBC溶血作用(P＜0.01)；能顯著抑制60Co γ射線致質粒PUC19DNA單鏈斷裂作用(P＜0.05或P＜0.01)；對VitC/Fe2+激發(fā)的肝勻漿GSH耗竭，茶多酚也具有顯著的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)。結論：茶多酚具有良好的抗氧化作用，能保護離體RBC，組織GSH，DNA免受氧自由基損傷。
主題詞 茶；溶血；質粒；谷胱甘肽
The antioxidative effect of tea polyphenols in vitro
JIANG Jian-Wei， HE Wen-Shan， YAN Yu-Xia， CEN Yin-Zhou1
Dept. of Biochemistry, Medical College, 1 Dept. of Chemistry,
JinanUniversity, Guangzhou (510632)
Abstract AIM:To assess the antioxidative effect of tea
polyphenols (TP) on free radical damage. MEHTODS: Used hemolysis,
changes of conformation of plasmid PUC19,
glutathione(GSH) levels of
mice liver homogenates as indexes. RESULTS: TP could reduce
significantly the degree of hemolysis of erythrocyte suspensions
induced by UV (P＜0.01). TP could reduce the degree of single-strain
break of plasmid PUC19 induced by 60Co γ-rays (P＜0.05 or P＜0.01).
TP could inhibit the exhaustion of GSH levels of mice liver
homogenate initiated by Vit C/Fe2+ (P＜0.05 or P＜0.01). CONCLUSION:
TP had a good antioxidative function, it can prevent RBC membrane,
plasmid DNA, tissue GSH suffering from oxygen free radical damage in
vitro.
MeSH Tea; Hemolysis; Plasmids;Glutathione
近年來研究發(fā)現茶葉除了有解渴提神的功效，還有消炎抑菌，降低血壓、血糖，抗衰老，抗氧化，抗癌，抗突變等功效［1，2］。茶葉中的主要活性成分是嘌呤類生物堿及多酚類化合物。茶多酚(tea polyphenols, TP)是茶葉中分離提純的多酚類化合物復合體，約占茶干物重的25％,它有30多種酚性物質組成,其中兒茶素類含量最多［1］。研究茶多酚清除生物自由基的作用與機理，對茶葉的藥用研究有較大的理論和應用價值。目前對活性氧自由基清除作用的研究通常用電子自旋共振法(ESR)進行［3，4］，但實驗儀器昂貴，操作也較復雜，一般實驗室難以應用。本文采用分光光度法及電泳法研究茶多酚對離體RBC膜，DNA，肝組織勻漿的抗氧化作用，來探討茶多酚的生物學活性。
材料與方法
一、材料：
茶多酚：廣東英德茶廠生產，純度＞95％。DTNB［5,5－二硫雙-(2-硝基苯甲酸)］，FLUKA公司出品。還原型谷胱甘肽(GSH)，上海酵母廠生產，生化試劑。PUC19購自華美公司?！ ±ッ鞣N小鼠，20～22 g，雄性，購自本校動物中心。新鮮健康人血，購自本院第一附屬醫(yī)院血庫。
二、方法：
1.照射條件：紫外線(ultravoilet, UV)照射用30 W UV燈進行，樣品分裝于10 mL燒杯內，置于燈正下方10 cm處，照射25 min。質粒PUC19照射采用60Co γ射線照射，樣品距源中心線60 cm，高120 cm，照射劑量率為16.67 Gy/min，照射劑量為100 Gy。
2.溶血試驗：人血RBC用生理鹽水(NS)洗滌后，作1:90稀釋，分組見表1,每組重復6管。加樣后用30W紫外燈照射25min，然后置4℃ 24 h，離心取上清，用722分光光度計于540 nm測吸光值(A)。
3.質粒PUC19 DNA斷裂試驗：取0.67 μg/μL粒2 μL，加入一定量的茶多酚，加入TE緩沖液（pH7.4），使終體積為32 μL，分組見表2。60Co γ射線100 Gy照射后，置4℃ 8h，用0.8％瓊脂糖電泳（電泳緩沖液為0.5×TBE，電泳70V 3h），后用溴乙錠（EB）染色15 min。采用凝膠圖像掃描系統(tǒng)掃描電泳結果，求出各孔超螺旋、開環(huán)型質粒所占的百分率。以λ DNA/HindⅢ Markers作為標準分子量對照物，以檢測各條電泳帶的DNA分子大小及構象。
4.肝勻漿GSH耗竭與測定：小鼠脫頸椎致死，立即取出肝組織，以4℃生理鹽水作5％(W/V)組織勻漿，取2 mL肝勻漿，加入一定量的茶多酚(TP)及生理鹽水(NS)，見表3，每組重復7管。加入1 mmol/L VitC和50 μmol/L FeSO4各0.2 mL，37℃水浴孵育60 min，激發(fā)氧自由基致GSH耗竭［5］。后用2 mL 10％TCA沉淀蛋白，離心取上清0.5 mL,加入0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH8.0)2 mL及0.04％DTNB顯色劑0.3 mL，混勻5 min后用722型分光光度計412 nm處測吸光值(A)。
以1 mmol/L GSH用同法作標準曲線，將上述吸光值代入GSH標準曲線回歸方程，求得組織GSH含量，單位以μmol/g濕重表示。
各項數據用平均數和標準差()表示，t檢驗判定兩組間差異的顯著性。
結果
(一)溶血試驗：結果見表1。
表1 TP拮抗UV致人血RBC溶血作用
Tab 1 Effect of TP on hemolysis degree induced by UV
TP n Absorbance
()
0 6 0.550±0.037
1.67 mg.mL-1 6 0.019±0.007*
3.33 mg.mL-1 6 0.011±0.002*
*P＜0.01, vs 0 group
實驗得出，UV可致人血RBC溶血，茶多酚顯著抑制UV致血RBC溶血作用，與對照組相比，差異十分顯著(P＜0.01)。
(二)質粒PUC19DNA單鏈斷裂測定：質粒PUC19是雙鏈環(huán)狀DNA，2 686 bp。雙鏈環(huán)狀DNA常呈超螺旋構象，若DNA單鏈斷裂則轉變?yōu)殚_環(huán)型質粒，若雙鏈斷裂則轉變?yōu)榫€型質粒。60Co γ射線照射可導致DNA鏈斷裂。實驗證明，低劑量(10～180 Gy)γ射線照射，導致部分DNA單鏈斷裂，呈超螺旋和開環(huán)型質粒，未發(fā)現線型質粒；高劑量(例400 Gy)照射，則導致DNA雙鏈斷裂，全部轉變?yōu)榫€型質粒。本實驗采用100 Gy γ射線照射，部分超螺旋DNA由于單鏈斷裂而轉變?yōu)殚_環(huán)型，茶多酚抑制了受照開環(huán)型質粒百分率的升高，即抑制了受照質粒DNA單鏈斷裂作用,與照射對照組相比,差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01)，結果見表2、圖1。
表2 60Co γ射線致質粒PUC19 DNA單鏈斷裂的測定
Tab 2 Test of single-strain break of plasmid PUC19
induced by 60 Co γ-rays ()
Group n TP
(mg.mL-1) Supercoil
(%) Open coil
(％)
Control1 2 0 69.68±2.47 30.32±2.47
Control2 3 0 49.06±2.28 50.94±2.28
TP1 3 2.81 55.97±2.84* 44.03±2.84*
TP2 3 5.62 59.32±4.24* 40.68±4.24*
TP3 3 8.43 62.78±0.93** 37.12±0.93**
Control1：control and not irradiated; Control 2:control and irradiated
*P＜0.05, **P＜0.01, vs control 2
Fig 1 Test of single-strain break of plasmid PUC19 induced by 60 Co γ－rays
A： Supercoil；B：Open coil
1： λDNA/Hind Ⅲ Markers； 2， 3： Control and not irradiated； 4，5，6： Control and irradiated； 7，8，9： TP1； 10，11，12： TP2；13，14，15： TP3
圖1 60Co γ射線致質粒PUC19 DNA單鏈斷裂的測定
(三)肝勻漿還原型谷胱甘肽(GSH)耗竭與測定：對Vit C/Fe2+誘使的小鼠肝勻漿GSH耗竭， 茶多酚有顯著的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)。結果見表3：
表3 TP拮抗 Vit C/Fe2+致使小鼠肝勻漿GSH耗竭的測定
Tab 3 Test of TP inbibition the exhaustion of GSH levels of mice
liver homogenate initiated by Vit C/Fe2+ (,n=7)
TP Absorbance(A) GSH(μmol.g-1)
0 0.164±0.025 7.96±0.23
0.45mg.mL-1 0.185±0.023* 9.12±0.12*
0.90mg.mL-1 0.229±0.030** 11.60±0.51**
*P＜0.05, **P＜0.01， vs 0 group
討論
溶血試驗是檢測生物抗氧化試驗的常用方法之一。UV照射RBC懸液，激發(fā)水產生.OH，.OH是目前已知的最強氧化劑［6］。.OH攻擊RBC膜上多不飽和脂肪酸導致脂質過氧化，致使膜通透性增加，血紅蛋白滲出導致溶血。茶多酚顯著抑制了UV導致的RBC溶血作用，說明茶多酚能抑制RBC膜的.OH的氧化損傷。
用質粒DNA代替基因組DNA來作為抗自由基損傷的檢測指標有以下優(yōu)點：DNA損傷程度檢測簡單、迅速；細胞內有較強的DNA修復系統(tǒng)，而質粒中沒有；細胞中有一系列抗氧化的酶(SOD，CAT，GSH-Px)，有一些代謝中間產物、氧化還原體系而質粒中沒有。采用質粒做實驗對象，避免了這些因素的干擾。質粒是雙鏈環(huán)狀DNA，呈超螺旋構象。在質粒提純過程中，由于機械剪切作用可能出現開環(huán)、線型質粒。我們選用的質粒PUC19為超螺旋，開環(huán)兩種。60Co γ射線導致質粒DNA輻射損傷主要是由于.OH作用引起的［7］。100 Gy照射質粒，其超螺旋型質粒百分率明顯下降，開環(huán)型質粒百分率明顯升高，說明自由基導致了DNA單鏈斷裂。而茶多酚抑制了開環(huán)型質粒百分率的升高，(P＜0.05或P＜0.01)，說明茶多酚抑制了.OH致質粒DNA的輻射損傷作用。
肝組織GSH水平測定亦可用作檢測抗氧化作用。GSH是谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）作用的必需底物，它可被氧化為氧化型谷胱甘肽。GSH可用DTNB顯色法直接測定［8］。Vit C/Fe2+是氧自由基發(fā)生系統(tǒng)［5］，氧自由基氧化GSH導致GSH耗竭，茶多酚抑制了氧自由基對GSH的氧化作用，說明茶多酚具拮抗氧自由基損傷的作用。
茶多酚是一類多酚類化合物，它具有還原性。本實驗證明，茶多酚對離體RBC，DNA或肝勻漿的氧自由基損傷具有顯著的抑制作用。
* 廣東省自然科學基金資助
作者單位：蔣建偉 嚴玉霞 暨南大學醫(yī)學院生化教研室
岑穎洲 化學系（廣州，510632）
何文珊 華南理工大學食品與生物工程學院
參考文獻
1 陳為鈞，萬圣勤.茶多酚藥效研究概況.中草藥，1993,24(9):493.
2 于新蕊，曲軍，叢月珠.茶葉的化學成分及藥理作用研究進展.中草藥，1995,26(4):219.
3 沈生榮，趙玉芳，楊賢強，等.茶多酚保護生物大分子的自由基機理.浙江農業(yè)大學學報，1995,21(4):361.
4 鄒曦露，萬謙，李美芬，等.茶多酚對鼠心肌缺血再灌產生氧自由基的清除.波譜學雜志，1995,12(3):237.
5 許實波，趙金華，胡群，等.軟珊瑚膽甾烯抗氧化作用研究.中國藥理學通報，1997,13(1):81.
6 李培峰，李文彬.自由基與抗衰老研究.見：方允中，鄭榮梁，沈文梅，主編.自由基生命科學進展.第2集.第1版.北京：原子能出版社，1994.7～11.
7 周麗君，方允中，章揚培，等.質粒pBR322的γ輻射損傷效應.輻射研究與輻射工藝學報，1993,11(1):28.
8 朱大江，褚先秋，都定元，等.充血性心力衰竭肝組織還原型谷胱甘肽與丙二醛變化及超微結構觀察.貴州醫(yī)藥，1996,2(3):136.
